Las interacciones microbianas cooperativas impulsan la segregación espacial en ambientes porosos

Jul 11, 2023

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4226 (2023) Citar este artículo

4363 Accesos

17 altmétrica

Detalles de métricas

El papel de las interacciones microbianas y los mecanismos subyacentes que dan forma a comunidades complejas de biopelículas no se conocen bien. Aquí empleamos un chip de microfluidos para representar ambientes subterráneos porosos y mostrar que las interacciones microbianas cooperativas entre bacterias de vida libre y formadoras de biopelículas desencadenan una segregación espacial activa para promover su respectivo dominio en microhábitats segregados. Durante la colonización inicial, los microbios de vida libre y formadores de biopelículas se segregan del inóculo planctónico mixto para ocupar el fluido ambiental y la superficie del grano. A diferencia de la exclusión espacial a través de la competencia, la segregación espacial activa es inducida por interacciones cooperativas que mejoran la aptitud de las poblaciones planctónicas y de biopelículas. Además, mostramos que Arthrobacter de vida libre induce la colonización de la superficie al eliminar el inhibidor de biopelículas, D-aminoácidos, y recibe beneficios de los bienes públicos secretados por las cepas formadoras de biopelículas. En conjunto, nuestros resultados revelan cómo las interacciones microbianas cooperativas pueden contribuir a la coexistencia microbiana en microhábitats segregados e impulsar la sucesión de comunidades de biopelículas subterráneas.

El subsuelo terrestre y oceánico alberga más del 80% de los microorganismos de la Tierra y, por tanto, es el principal hábitat microbiano de nuestro planeta1,2. A diferencia de los ambientes acuosos (por ejemplo, el océano abierto), donde los microbios viven en su mayoría en libertad (planctónicos), el subsuelo proporciona una superficie inmensamente grande para la adhesión microbiana. Los microbios adheridos a la superficie secuestran nutrientes del agua de los poros y crecen en densos conjuntos de múltiples especies, llamados biopelículas3,4. La proximidad de diversas especies en biopelículas facilita diversas interacciones entre ellas, como la detección de quórum y el metabolismo sinérgico, que determinan los rasgos y funciones de la comunidad5,6,7.

En las últimas décadas, se han realizado investigaciones teóricas y experimentales para analizar las intrincadas interacciones que dictan la estructura de la comunidad de biopelículas del subsuelo. Se ha descubierto que los microorganismos cooperativos, como los socios de alimentación cruzada, se coagregan en comunidades de biopelículas para permitir beneficios recíprocos8,9,10. Por el contrario, los microorganismos mutuamente antagónicos tienden a excluirse unos a otros de los nichos locales y a segregarse espacialmente7,11. Además de las consecuencias funcionales directas, la estructura física de los ambientes subterráneos puede determinar la estabilidad ecológica y las actividades funcionales al modular la distribución espacial de genotipos cooperativos y competitivos. En comparación con ambientes bien mezclados, la segregación espacial bajo condiciones estructuradas equilibra las interacciones competitivas y cooperativas para estabilizar la comunidad12. Por ejemplo, la separación física en medios porosos permite la coexistencia de especies de crecimiento lento con competidores de rápido crecimiento, ya que la rápida formación de biopelículas bloquea el flujo de fluido y redirige los nutrientes a sus competidores13,14. Un experimento reciente también demostró que la segregación espacial de consorcios de biopelículas gobierna la alimentación cruzada de metabolitos y el crecimiento microbiano mediante el ajuste de la fidelidad de la transmisión de señales de detección de quórum15. Sin embargo, la comprensión actual de las comunidades de biopelículas subterráneas derivadas de interacciones se basa en gran medida en comunidades de especies duales. Aún no se comprende bien cómo las interacciones microbianas dan forma a diversas comunidades de biopelículas en entornos espacialmente estructurados.

Aquí, investigamos el proceso de colonización de biopelículas en un medio poroso donde las bacterias del suelo se autoensamblan en comunidades microbianas estructuradas. Utilizando microfluidos, secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA e hibridación fluorescente in situ (FISH), observamos que durante el desarrollo temprano de biopelículas, las especies deficientes en biopelículas prepararon activamente el entorno de microescala para que los microbios formadores de biopelículas colonicen las superficies. Además, realizamos exometabolómica, transcriptómica, análisis de interacción por pares y manipulación genética para descubrir los mecanismos de interacciones interespecíficas. Encontramos que la interacción entre especies deficientes en biopelículas y especies formadoras de biopelículas impulsa la sucesión de comunidades microbianas a través de una segregación espacial activa en el ambiente subterráneo.

Desarrollamos un chip de microfluidos que consta de una serie de pilares (análogos a los granos del subsuelo) para parecerse a los medios porosos del subsuelo (Fig. 1a y Fig. 1 complementaria). Se caracterizó el transporte coloidal y la retención en la cámara de microfluidos para evaluar la residencia de células planctónicas. Según la curva de avance de las microesferas fluorescentes (Figura 2 complementaria), el tiempo medio de viaje de las partículas coloides fue de 51,48 ± 2,16 min. Sugiere que tanto la biopelícula como las células planctónicas tienen suficiente tiempo de residencia para crecer en el medio poroso. El dispositivo de microfluidos se inoculó con una comunidad microbiana compleja extraída del suelo y luego se le suministró el medio de extracto de suelo preparado a partir de la misma muestra de suelo. El desarrollo de biopelículas se inició con pequeñas colonias microbianas formadas en el grano (Fig. 1b). Después de 72 h de crecimiento, las biopelículas comenzaron a cubrir la superficie del grano y se extendieron hacia el espacio poroso y finalmente obstruyeron los canales de la matriz porosa. Según el análisis de imágenes cuantitativo, la rugosidad de la biopelícula aumentó significativamente después de 72 h (Fig. 1c). El aumento de la rugosidad, que normalmente indica la formación de biopelículas maduras, amplía la interfaz líquido-biopelícula para permitir una transferencia eficiente de masa de nutrientes a las biopelículas16,17. La cantidad de células planctónicas y de biopelículas se cuantificó mediante qPCR. Tanto los perfiles de crecimiento de las células planctónicas como las de biopelícula en la cámara de microfluidos siguieron un patrón de crecimiento logístico, que alcanzó una meseta al final de la incubación (Fig. 1d). Excepto durante las 24 h iniciales, la cantidad de células de biopelícula fue considerablemente mayor que la de la comunidad planctónica.

a Esquema del dispositivo de microfluidos que imita el entorno poroso del subsuelo. La composición de la comunidad microbiana se perfila mediante la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA. El efluente está sujeto a análisis exometabolómico. b El desarrollo de la arquitectura de biopelículas en el ambiente poroso. Las células de biopelícula se tiñen con SYTO 9 (verde). La barra de escala representa 50 μm. El experimento se repitió en cuatro chips de microfluidos independientes con resultados similares. c La dinámica del espesor y la rugosidad de la biopelícula (n = 4 chips × 15 granos). La rugosidad de la biopelícula se calculó como la desviación estándar del espesor de la biopelícula en las superficies de los granos individuales. Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar. d La cantidad de células planctónicas y de biopelícula en la cámara de microfluidos determinada por qPCR (n = 4 chips). La línea continua muestra una proporción decreciente de células planctónicas a medida que aumenta el desarrollo de biopelículas. Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar.

Para investigar la sucesión de la comunidad durante el desarrollo de la biopelícula, se monitoreó la dinámica total de la comunidad microbiana en los chips de microfluidos mediante secuenciación de amplicones 16S. La disimilitud de Bray-Curtis de las comunidades microbianas totales entre intervalos de tiempo adyacentes disminuyó a medida que avanzaba el crecimiento de la biopelícula (Fig. 2a). Durante la etapa inicial, la diversidad y riqueza de la comunidad exhibieron una disminución significativa (Figura complementaria 3). Se observaron cambios nominales después del desarrollo de biopelículas maduras (>72 h) y las comunidades se acercaron a un estado estable. ASV1 Pseudomonas y ASV2 Arthrobacter fueron las dos variantes de secuencia de amplicones (ASV) más abundantes durante todo el período de incubación y representaron el 76,4% del total de lecturas (Fig. 2b). La abundancia relativa de estos dos ASV aumentó simultáneamente en la etapa inicial (<48 h) pero varió después de la formación de una biopelícula madura (Fig. 2b).

a La disimilitud de Bray-Curtis de comunidades entre intervalos de tiempo adyacentes se correlaciona negativamente con los períodos de incubación (r de Pearson bilateral = −0,754, p = 4,69 × 10−11). La línea sólida representa la regresión lineal, mientras que el sombreado gris indica el intervalo de confianza del 95%. b Las abundancias relativas de los 20 ASV PRINCIPALES (que cubren el 86,3% del total de lecturas) en la comunidad microbiana total. Los colores de las líneas corresponden a diferentes ASV en la leyenda de la taxonomía a la derecha. La línea continua representa el valor promedio y las áreas sombreadas indican la desviación estándar de tres réplicas biológicas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c La importancia relativa de diferentes procesos ecológicos en el ensamblaje de la comunidad de biopelículas (n = 9 comparaciones entre tres réplicas biológicas en cada momento y tres réplicas biológicas para el inóculo), incluida la selección homogénea (HoS), la selección heterogénea (HeS), la dispersión homogénea (HD) ), dispersión (DL) y deriva (DR). Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar de la importancia relativa de los procesos deterministas y estocásticos. Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0,05, ANOVA unidireccional). Para conocer los valores de p exactos, consulte la Tabla complementaria 1. d La contribución relativa de diferentes géneros a la sucesión de la comunidad. Las columnas están coloreadas según la taxonomía (consulte la leyenda de la taxonomía a la derecha). e Imágenes FISH de biopelícula en la cámara de microfluidos. La biopelícula se hibrida simultáneamente con las sondas para Arthrobacter (ART179-Alexa546, rojo) y Pseudomonas (PSE227-Alexa488, verde). Las células de biopelícula se tiñen con DAPI (azul). La proporción de Pseudomonas y Arthrobacter en la biopelícula se calcula en función del área de células fluorescentes verdes y rojas (n = 4 chips × 15 granos). Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar. La barra de escala representa 50 μm.

La importancia relativa de los diferentes grupos taxonómicos para la sucesión total de la comunidad se infirió mediante un análisis de modelo nulo basado en bins filogenéticos (iCAMP)18. Este marco divide los ASV observados en diferentes grupos taxonómicos según las relaciones filogenéticas. La importancia relativa de los procesos ecológicos que gobiernan las rotaciones de cada grupo está determinada por el análisis del modelo nulo basado en el Índice de Relación Neta beta (βNRI) y la métrica de Raup-Crick modificada (RC). La comparación por pares con βNRI < −1,96 es indicativa de selección homogénea, mientras que la comparación con βNRI > 1,96 se interpreta como selección heterogénea. La métrica de disimilitud taxonómica RC se aplica para las comparaciones por pares con |βNRI| ≤ 1,96. Los valores de RC >0,95 o <−0,95 representan dispersión homogeneizante o limitación de dispersión, mientras que |RC| ≤ 0,95 se interpreta como deriva. La importancia relativa de los procesos individuales se pondera por la abundancia relativa de cada grupo taxonómico y se suma para estimar su importancia relativa en el control de la sucesión comunitaria. El resultado revela que la sucesión de la comunidad microbiana fue impulsada por una selección homogénea, cuya importancia relativa aumentó del 39,5% a más del 90,0% con el desarrollo de la biopelícula (Fig. 2c). A nivel de género, Pseudomonas hizo la contribución más destacada a la sucesión de la comunidad, seguida por Arthrobacter, que contribuyó con más del 15% durante la etapa inicial (≤48 h) (Fig. 2d). Estos resultados demuestran que después de un período estocástico temporal (≤12 h), las comunidades microbianas fueron impulsadas por condiciones ambientales abióticas y bióticas homogéneas y Pseudomonas y Arthrobacter fueron los taxones clave que dieron forma a la estructura comunitaria.

Para rastrear visual y espacialmente el destino de Pseudomonas y Arthrobacter durante el desarrollo de biopelículas, se realizó FISH in situ en los chips de microfluidos con sondas específicas de género. Después de las 12 h iniciales de unión, se identificó una cantidad mínima de bacterias asociadas a la superficie como Pseudomonas y Arthrobacter y la mayoría de ellas aún permanecían en la comunidad planctónica (Fig. 2e y Fig. 4 complementaria). Sorprendentemente, la proporción de Pseudomonas en la biopelícula aumentó a 70,7 ± 14,2% a las 36 h, durante las cuales su abundancia relativa en la comunidad planctónica disminuyó simultáneamente de 68,4 ± 5,2% a 18,5 ± 8,6% (Fig. 2e y Fig. complementaria 4). . Según los análisis de qPCR y secuenciación de amplicones (Fig. 1d, 2b y Fig. complementaria 4), 19,5 ± 12,7% de Pseudomonas en la cámara de microfluidos habitaban biopelículas a las 12 h. La relación aumentó aún más a 97,3 ± 10,0% a las 36 h. La mayor proporción de células sésiles de Pseudomonas sugiere que Pseudomonas experimentó una transición de planctónica a formadora de biopelículas en la etapa inicial del desarrollo de biopelículas. Por el contrario, todavía se observó raramente Arthrobacter en la biopelícula después de 36 h de crecimiento, mientras que su proporción en la comunidad planctónica aumentó de 15,8 ± 2,3% a 64,5 ± 10,4%, convirtiéndose en el taxón más prevalente en las comunidades planctónicas (Fig. 2e y Fig. Suplementaria). .4). La aparición de parches dominados por un género representa la aparición de segregación espacial en la etapa inicial del desarrollo de biopelículas, a través de la cual Arthrobacter de vida libre y Pseudomonas formadoras de biopelículas ocuparon el fluido ambiental y la superficie del grano, respectivamente. La dominancia en la biopelícula aumenta la frecuencia de interacciones entre células con genotipos similares19,20,21,22, mientras que los taxones de plancton prevalentes pueden ejercer un fuerte impacto en el conjunto de exometabolitos23,24. La aparición de segregación espacial es consistente con la elevada importancia de la selección en la asamblea comunitaria (Fig. 2c, e), lo que indica que la fuerza selectiva emerge a través de la organización espacial.

En la etapa tardía, se observó que biopelículas de Pseudomonas densamente empaquetadas recubrían el grano y cubrían los espacios porosos, y la proporción de Pseudomonas en la biopelícula aumentó a 84,5 ± 12,3% a las 96 h (Fig. 2e). La comunidad planctónica estaba dominada por bacterias dispersas de la comunidad de biopelículas, que consistían principalmente en Pseudomonas, Rhodococcus y Lysinibacillus (Figura complementaria 4). Dado el aumento simultáneo de la abundancia relativa (Fig. 2b), planteamos la hipótesis de que una posible interacción positiva entre Pseudomonas y Arthrobacter induce la segregación espacial.

Para desenredar los mecanismos subyacentes en la segregación espacial, caracterizamos el rendimiento del crecimiento individual y la interacción por pares de cepas bacterianas aisladas de los chips de microfluidos (Fig. 3a). Se eligieron los veinte aislados más abundantes de cuatro géneros diferentes, que en conjunto representaron el 78,9% de la abundancia total. Su crecimiento planctónico y formación de biopelículas en microplacas se analizaron mediante mediciones de densidad óptica y tinción con violeta cristal, respectivamente. Aunque todos los aislados mostraron un crecimiento planctónico sustancial en el medio intensivo de extracto de suelo (ISEM), las cepas de Arthrobacter exhibieron una capacidad mínima de formación de biopelículas (Fig. 3a). Esto sugiere que la extinción de Arthrobacter en la última etapa del crecimiento de la biopelícula se atribuyó a su deficiencia en la formación de biopelículas y a su falla en la colonización permanente en presencia del lavado continuo con ISEM. Además, se llevaron a cabo experimentos de interacción por pares para probar la hipótesis de que una interacción positiva entre Arthrobacter de vida libre y los habitantes de la biopelícula indujo la segregación espacial (Fig. 3a). Los resultados revelan que la mayoría de las interacciones intergenéricas entre las cepas de Arthrobacter y los aislados formadores de biopelículas, Pseudomonas y Rhodococcus, fueron positivas (Fig. 3a). 20 de 25 combinaciones de cocultivo entre Arthrobacter y Pseudomonas se asignaron como interacciones positivas (Yco > Ysum).

a El crecimiento individual y la interacción de cocultivo por pares entre cepas de Arthrobacter y aislados de otros 3 géneros en ISEM. El crecimiento planctónico individual se mide por OD600. El rendimiento de la biopelícula se cuantifica mediante OD590 después de la tinción con cristal violeta. Con base en el rendimiento de biopelícula de monocultivo mínimo (Ymin), promedio (Yave), máximo (Ymax) y suma (Ysum) de cada miembro en cocultivo y el rendimiento de biopelícula de cocultivo (Yco), la interacción por pares se puede clasificar como positivo (Yco > Ysum), negativo fuerte (Yco < Ymin) o negativo débil (Ysum ≥ Yco ≥ Ymin). b Genes clave relacionados con la formación de biopelículas expresados ​​diferencialmente de ASV1 P. fluorescens en cocultivo con ASV2 A. ramosus. Los números entre paréntesis representan el número de genes expresados ​​diferencialmente con las mismas funciones. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. La interacción en ISEM condicionada por Arthrobacter planctónico (c) y aislados formadores de biopelículas (d). En función del biofilm o crecimiento planctónico en medio condicionado (Yc) y medio no condicionado (Yu), la interacción se puede clasificar como positiva (Yc ≥ Yu), negativa débil (1 > Yc/Yu ≥ 0,5) o negativa fuerte (Yc/ Yu < 0,5). Los datos de origen para las Fig. 3a, c se proporcionan como un archivo de datos de origen. La DO600 medida para la Fig. 3d se representó en la Fig. 10a complementaria.

Dado que el ensayo de cristal violeta cuantificó la biomasa total de biopelículas en cocultivo, la abundancia de Arthrobacter y aislados formadores de biopelículas en plancton, biopelículas y comunidad total se cuantificó utilizando qPCR para evaluar su aptitud individual. El número total de células de Arthrobacter y cepas formadoras de biopelículas en 41 y 36 de 50 mezclas de cocultivo fueron significativamente mayores que las del monocultivo, respectivamente (Figuras complementarias 5 y 6). De acuerdo con la estructura espacial comunitaria observada en las cámaras de microfluidos (Fig. 2e), la biopelícula de cocultivo estaba compuesta principalmente por especies formadoras de biopelículas (frecuencia media de cepas formadoras de biopelículas en la biopelícula = 0,605, prueba de rango con signo de Wilcoxon versus 0,5 , n = 50 combinaciones, p = 8,88 × 10−5), y el plancton estuvo dominado por Arthrobacter (frecuencia media de cepas de Arthrobacter en plancton = 0,878, prueba de rangos con signo de Wilcoxon versus 0,5, n = 50 combinaciones, p = 7,79 × 10-10). Después de 24 h de crecimiento, las frecuencias de Arthrobacter en las 50 combinaciones de cocultivo fueron comparables a las proporciones iniciales (prueba de rangos con signo de Wilcoxon versus frecuencia de Arthrobacter en el inóculo, n = 4 réplicas para cada combinación, p > 0,05), lo que sugirió que Arthrobacter y las especies formadoras de biopelículas no se excluyeron entre sí en el cocultivo.

Se realizaron análisis genómicos y transcriptómicos integrados de dos combinaciones de cocultivos (ASV2 A. ramosus-ASV1 P. fluorescens y ASV2 A. ramosus-ASV11 R. erythropolis) para revelar las respuestas transcripcionales en interacciones interespecíficas. El cocultivo con A. ramosus indujo la expresión diferencial de 2165 y 161 genes en P. fluorescens y R. erythropolis, respectivamente. Según el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), las vías metabólicas que incluyen la fosforilación oxidativa, el metabolismo del carbono, los ribosomas y el ciclo del citrato de P. fluorescens se activaron en el cocultivo (Figura complementaria 7). Además de las vías metabólicas reguladas positivamente, los genes de P. fluorescens relacionados con la formación de biopelículas se expresaron altamente. Tanto los genes de biosíntesis para las moléculas de señalización de biopelículas intracelulares como intercelulares, es decir, c-di-GMP y la señal de quinolona (PQS), estuvieron significativamente regulados positivamente en el cocultivo (Fig. 3b). La activación de la síntesis de señales de biopelículas correspondió a las vías de síntesis y exportación reguladas al alza para exopolímeros, incluida la adhesina LapA, el polisacárido extracelular y el lipopolisacárido. Además, los genes de P. fluorescens responsables de la síntesis de bienes públicos cooperativos como el sideróforo (estafiloferrina) y las lanzaderas de electrones (riboflavina (RF), flavina mononucleótido (FMN) y flavina adenina dinucleótido (FAD)) se regularon significativamente para proporcionar un colectivo. beneficio (Fig. 3b). El análisis de GESA reveló que el cocultivo también reguló positivamente el metabolismo de los aminoácidos y la biosíntesis de metabolitos secundarios en R. erythropolis (Figura complementaria 7). Cada una de estas dos cepas formadoras de biopelículas activó cuatro vías metabólicas de aminoácidos diferentes. Un total de 237 y 263 genes implicados en la biosíntesis de cofactores y metabolitos secundarios se enriquecieron positivamente en P. fluorescens y R. erythropolis, respectivamente. La formación de biopelículas inducida se validó en la cámara de microfluidos. A. ramosus indujo un aumento de 2,3 y 4,4 veces en el espesor de la biopelícula de P. fluorescens y R. erythropolis, respectivamente (Figura complementaria 8). Mientras tanto, solo 126 y 88 genes de la cepa A. ramosus se expresaron diferencialmente en el cocultivo con P. fluorescens y R. erythropolis en comparación con el monocultivo (Figura complementaria 9). En estos dos sistemas de cocultivo, A. ramosus compartió genes regulados positivamente para la adquisición de hierro, como efeUOB, y genes regulados negativamente para el transporte de péptidos/níquel.

Como Arthrobacter de vida libre y las bacterias formadoras de biopelículas estaban segregadas espacialmente en el ambiente poroso (Fig. 2e y Fig. 4 complementaria), suponemos que la interacción cooperativa estuvo mediada por metabolitos extracelulares. Para probar esto, se cultivaron aislados formadores de biopelículas en un medio acondicionado, preparado mezclando ISEM fresco y medio gastado de Arthrobacter en una proporción de 1:1 (Fig. 3c). El medio gastado de Arthrobacter fue el sobrenadante del cultivo libre de células de Arthrobacter cultivado en ISEM durante 48 h. De acuerdo con los experimentos de cocultivo, el medio condicionado por cepas de Arthrobacter mejoró sustancialmente la formación de biopelículas de Pseudomonas y Rhodococcus (Fig. 3c). Por otro lado, ISEM condicionado por ASV1 P. fluorescens y ASV11 R. erythropolis mejoró significativamente el crecimiento de la mayoría de las cepas de Arthrobacter (Fig. 3d y Fig. Suplementaria 10a). El crecimiento mejorado también se observó en el medio mínimo M9 condicionado por ASV1 P. fluorescens y ASV11 R. erythropolis (Figura complementaria 10b), lo que sugirió que las cepas de Arthrobacter se beneficiaron de los metabolitos secretados por las cepas formadoras de biopelículas. Como se detectaron bienes públicos como sideróforo, FMN y FAD en el sobrenadante de ASV1 P. fluorescens cultivado en ISEM (Figuras complementarias 11 y 12), investigamos más a fondo si Arthrobacter explotó estos bienes públicos mediante la construcción del mutante de síntesis de sideróforo en ASV1 P. .fluorescens (ΔsfnaD) y añadiendo flavinas a los medios de cultivo. La eliminación del gen de la sideróforo sintetasa redujo el crecimiento de la mayoría de las cepas de Arthrobacter en el medio gastado de ASV1 P. fluorescens (Figura complementaria 13). Mientras tanto, la suplementación con flavinas al mismo nivel que el ISEM condicionado por ASV1 P. fluorescens mejoró significativamente el crecimiento de Arthrobacter tanto en el medio ISEM como en el medio M9 (Figura 14 complementaria). Estos resultados respaldan nuestra hipótesis de que los metabolitos excretados de Arthrobacter de vida libre pueden inducir la segregación espacial al promover la formación de biopelículas, lo que simultáneamente mejora la aptitud de Arthrobacter en comunidades planctónicas a través de la producción de bienes públicos.

Para comprender la segregación espacial impulsada por exometabolitos, se desentrañó la dinámica de los metabolitos extracelulares en los efluentes de chips de microfluidos mediante análisis metabolómicos no específicos. Se identificaron un total de 162 metabolitos, entre los cuales los aminoácidos (AA) y sus derivados (24,0%) y los ácidos grasos (13,0%) fueron los principales constituyentes. El análisis de Procrustes reveló una correlación fuerte y altamente significativa entre los exometabolitos y la composición total de la comunidad en los chips de microfluidos (Fig. 4a). De acuerdo con las estructuras comunitarias, los perfiles de exometabolitos en la etapa inicial eran distintos de los de la etapa tardía. Todos los exometabolitos medidos se dividieron en tres grupos según su dinámica durante el desarrollo de la biopelícula, incluidos los liberados (grupo 1), los consumidos (grupo 2) y los demás (grupo 3) (Figuras complementarias 15 a 18). Los supuestos carbohidratos (por ejemplo, lactosa) y purinas se consumieron rápidamente después de la inoculación (Figura complementaria 17). Varios AA putativos y sus derivados, agrupados en el grupo 1, se acumularon durante el desarrollo de la biopelícula (Figura complementaria 16). Se calculó la correlación de rango de Spearman para evaluar la direccionalidad de las relaciones microbio-AA (Fig. 4b). Durante todo el período de incubación, 11 de 18 aminoácidos identificados se correlacionaron negativamente con la abundancia relativa de Arthrobacter y 8 de ellos mostraron una relación positiva con Pseudomonas. Esto implica que estos dos géneros dominantes desempeñan funciones diferentes en el metabolismo de los aminoácidos.

un gráfico de escalamiento multidimensional no métrico (NMDS) de la composición total de la microbiota de la rotación de Procrustes con el gráfico NMDS del metaboloma (correlación de Procrustes = 0,72, p = 0,001). b Correlación entre los ASV (abundancia relativa> 0,1% en todas las comunidades microbianas en chips de microfluidos) y los aminoácidos. Solo se muestran aquellos con coeficientes de correlación de rangos de Spearman (|r| ≥ 0,5, ***p ≤ 0,001, **p ≤ 0,01, *p ≤ 0,05). ACC, ácido 1-aminociclopropano 1-carboxílico; Ect, ectoína; Ácido 2-Akbt, 2-amino-3-oxobutanoico. c La acumulación de aminoácidos totales en el sobrenadante (n = 3 chips). d La dinámica de DAA durante el desarrollo de biopelículas exhibe un patrón en V (n = 3 chips). Las áreas sombreadas representan la desviación estándar de tres réplicas biológicas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como la metabolómica puede producir falsos positivos en la identificación de metabolitos, las concentraciones de aminoácidos libres y sus enantiómeros se determinaron mediante detección espectroscópica después de la derivatización. La concentración total inicial de aminoácidos libres en ISEM fue de 63,7 mg/l (Fig. 4c), y consistió principalmente en Thr, Val, Met, Leu, Phe, His y Lys. De acuerdo con el análisis metabolómico no dirigido, la concentración total de aminoácidos aumentó sustancialmente en la última etapa, hasta una concentración final superior a 300 mg/l. Mientras tanto, la dinámica de los DAA exhibió un patrón en "forma de V" que disminuyó tras la inoculación y se acumuló después de 48 h de crecimiento (Fig. 4d). El consumo de D-aminoácido se alineó bien con el crecimiento de Arthrobacter, lo que sugiere un papel potencial de Arthrobacter en el consumo de D-aminoácido. Dado que se sabe que los D-aminoácidos suprimen la formación de biopelículas mediante la inhibición de la unión inicial, la producción de EPS y la detección de quórum26,27,28,29, proponemos que el consumo de D-aminoácidos es el rasgo metabólico central para desencadenar la segregación espacial.

Las cepas aisladas se cultivaron en ISEM para probar la capacidad de eliminación de DAA. La concentración inicial de DAA de ISEM fue de 44,1 mg/l. Las cepas de Arthrobacter eliminaron aproximadamente el 90% de los DAA en 48 h y mostraron la mayor capacidad de consumo de DAA (Fig. 5a). Mientras tanto, aproximadamente el 60 % de la concentración de DAA permaneció en el cultivo de Pseudomonas. En comparación con la de ISEM, la concentración de DAA en el ISEM condicionado por Arthrobacter disminuyó a ~25 mg/L (ISEM fresco mezclado con el sobrenadante del cultivo de Arthrobacter en una proporción de 1:1). Con una concentración reducida de DAA, la formación de biopelículas de Pseudomonas y Rhodococcus en el medio acondicionado mejoró en comparación con la de ISEM (Fig. 3c). Para validar el papel de los DAA en la formación de biopelículas, se complementaron varias cantidades de DAA en el medio condicionado. Se encontró que la formación de biopelículas se inhibía con el aumento de la concentración de DAA. Se encontró que una concentración de 45 mg / L de DAA en medios condicionados, que era equivalente al nivel de ISEM, causaba una reducción de 31,8 ± 7,9% y 27,7 ± 6,4% en la formación de biopelículas de Pseudomonas y Rhodococcus (Fig. 5b). En general, estos resultados respaldan firmemente nuestra hipótesis de que Arthrobacter induce la segregación espacial mediante la eliminación del inhibidor de la biopelícula, los DAA.

a Los AAD residuales en ISEM después de 48 h de crecimiento de cada aislado (n = 3 réplicas biológicamente independientes). El gráfico de barras muestra el total de AAD residuales en el cultivo. Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar. b La formación relativa de biopelículas en el medio condicionado con diferentes niveles de DAA (n = 5 aislados para cada género × 3 réplicas). La biomasa de biopelícula de cada aislado, indicada por OD590, se normaliza a la desarrollada en el medio acondicionado con 25 mg/L de D-aminoácido. Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0,05, ANOVA unidireccional). Para obtener valores de p exactos, consulte la Tabla complementaria 5. Los diagramas de caja muestran el rango intercuartil de 1,5 × (bigotes), los cuartiles y la mediana de la biomasa relativa de biopelículas.

Los ambientes porosos del subsuelo, como el suelo y los sedimentos, son uno de los principales hábitats microbianos de la Tierra1,2. En estos ambientes, la formación de biopelículas es una estrategia de vida fundamental para los microorganismos. Las intrincadas interacciones dentro de las comunidades locales dan lugar a la diversidad y estabilidad de la comunidad. Sin embargo, rara vez se examina el papel de las interacciones microbianas en la configuración de sucesiones complejas de comunidades de biopelículas naturales. Aquí, utilizando un entorno de chip de microfluidos, demostramos que una interacción microbiana positiva impulsa la estructura espacial de la comunidad durante la colonización de biopelículas. Arthrobacter, con deficiencia de biopelículas o más planctónico, desencadena la formación de biopelículas mediante la eliminación de inhibidores de biopelículas. Con la disminución del nivel de inhibidores de biopelículas, Pseudomonas, el género más abundante en la comunidad total, redujo su proporción en el fluido ambiental y cambió a un estilo de vida sésil. La segregación espacial también se observó en cocultivos que contenían cepas de Arthrobacter y Pseudomonas con densidades celulares iniciales comparables. Los análisis de interacción por pares revelaron que Arthrobacter y las cepas formadoras de biopelículas dominaron el plancton y la biopelícula en los sistemas de cocultivo, respectivamente. La proporción de Pseudomonas que habitaban biopelículas en cocultivo fue significativamente mayor que en monocultivo (p <0,001, ANOVA unidireccional, Tabla complementaria 6). Aunque el crecimiento en medio mínimo ISEM y M9 con diferentes niveles de DAA sugiere que Arthrobacter no obtiene beneficios de aptitud física a través de la hidrólisis de DAA (Figura 19 complementaria), recibe beneficios de retorno de especies formadoras de biopelículas que secretan bienes públicos. La interacción mutuamente beneficiosa facilita la ocupación de nichos segregados por Arthrobacter de vida libre y bacterias formadoras de biopelículas y da forma a la organización espacial de la comunidad. Indica que las minorías microbianas planctónicas pueden imponer una fuerte presión de selección sobre la sucesión de la comunidad de biopelículas, al actuar como eliminadores de inhibidores y, a su vez, mejorar su propia aptitud en el fluido de los poros.

Los resultados simulados y experimentales han demostrado que la segregación espacial es generalmente el resultado de interacciones competitivas en entornos estructurados5,30,31. Como los microorganismos competidores se excluyen recíprocamente entre sí, la segregación espacial contribuye a la coexistencia estable de los competidores y aumenta la diversidad de la comunidad12,32. En particular, las especies formadoras de biopelículas obtienen ventajas competitivas sobre las especies de vida libre o deficientes en biopelículas en ambientes naturales. Estudios anteriores encontraron que las especies formadoras de biopelículas superan a las células de vida libre asfixiándolas o cortando el acceso a los nutrientes33,34. Por el contrario, mostramos que las especies de vida libre, que hasta ahora se reconocen como especies superadas, pueden de hecho establecer una cooperación mutualista con las células formadoras de biopelículas. En la etapa inicial de la colonización, los microbios de vida libre eliminan el inhibidor universal de biopelículas para inducir la formación de biopelículas. Con un efecto inhibidor reducido, las células formadoras de biopelículas salen del fluido ambiental para colonizar las superficies de los granos y, a cambio, secretan bienes públicos. Estos primeros pobladores de la superficie pueden adelantarse o modificar rápidamente los microhábitats, lo que afecta la colonización de especies que llegan tardíamente e impulsa la posterior sucesión comunitaria8,35,36. Esto indica que la interacción cooperativa entre socios de vida libre y formadores de biopelículas puede desempeñar un papel central durante la colonización de territorios vírgenes.

Encontramos que los DAA son los metabolitos clave que median la segregación espacial en nuestro sistema. Los cambios en los DAA durante la colonización de biopelículas revelan un patrón en forma de V. En la última etapa, la frecuencia de Arthrobacter capaz de hidrolizar eficientemente los AAD disminuyó significativamente debido a su deficiencia en la formación de biopelículas. El tiempo medio de viaje de los coloides en la cámara de microfluidos disminuyó de 51,48 ± 2,16 a 30,72 ± 5,16 minutos después del desarrollo de la biopelícula (prueba t de Student de dos colas, n = 3 réplicas independientes para cada condición, p = 0,011, figura complementaria 2 ), lo que indica una elución acelerada de Arthrobacter planctónico en la etapa tardía. La extinción de Arthrobacter en los ambientes porosos condujo a una disminución de las capacidades metabólicas de la comunidad microbiana restante hacia los DAA, cuya concentración en el efluente aumentó gradualmente hasta el nivel original en ISEM (Fig. 4d). Como grupo común de metabolitos secundarios y constituyentes principales de las paredes bacterianas, estos enantiómeros de aminoácidos pueden excretarse activamente y liberarse pasivamente al entorno circundante37,38. Se detectaron micromoles de DAA por gramo de peso seco en sedimentos y suelos37,39,40. Como los DAA en este rango de concentración son suficientes para suprimir la formación de biopelículas26,27, pueden desempeñar un papel generalizado en el gobierno de la estructura de la comunidad de biopelículas en una amplia gama de ecosistemas.

Este estudio proporciona una comprensión mecanicista de cómo las interacciones microbianas pueden gobernar la sucesión de comunidades de biopelículas en ambientes porosos del subsuelo. Se requieren mayores esfuerzos para abordar las funciones de las diferentes interacciones bióticas, como la competencia y el mutualismo, en la configuración de la estabilidad ecológica y las funciones de comunidades complejas de biopelículas, y para validar estos hallazgos en suelos y comunidades microbianas reales. Esta plataforma experimental se puede adaptar para permitir la visualización in situ e integrar múltiples tecnologías ómicas para dilucidar la dinámica espaciotemporal de las actividades microbianas y los mecanismos subyacentes, lo que mejorará nuestra comprensión de la organización espacial de las comunidades microbianas y los rasgos funcionales en los ecosistemas.

Se tomaron muestras de suelo de un arrozal de la Estación Nacional de Investigación y Observación de Agroecosistemas (provincia de Jiangxi, China, 116°55'E, 28°15'N) a una profundidad de 0 a 20 cm, en noviembre de 2017. Muestras de suelo Se trituraron para pasar a través de un tamiz de malla 10 y los microorganismos se extrajeron mediante centrifugación en gradiente de Nycodenz41.

Se preparó un medio intensivo de extracto de suelo (ISEM) basado en extracto de suelo utilizando la misma muestra de suelo para la extracción de microorganismos del suelo siguiendo un trabajo previo42. Brevemente, se mezclaron 500 g de suelo seco con 1,3 l de metanol al 80 % y se agitaron durante la noche a temperatura ambiente. Se recogió el sobrenadante y se extrajo el suelo residual por segunda vez. Los dos sobrenadantes se combinaron, se pasaron a través de un papel de filtro de celulosa y se sometieron a liofilización. La muestra liofilizada se solubilizó en 200 ml de agua y se filtró a través de un filtro de 0,22 µm. El filtrado se denominó solución de extracto de suelo. Cada litro de ISEM consistió en 0,2 L de solución de extracto de suelo, 0,23 g KH2PO4, 0,23 g K2HPO4, 0,23 g MgSO4·7H2O, 0,33 g NH4NO3, 0,25 g NaHCO3, 5 mg de cada D-aminoácido (D-valina, D-metionina , D-leucina, D-fenilalanina, D-treonina y D-triptófano), 1 ml de la solución madre de vitaminas (clorhidrato de tiamina, 0,5 g/L; riboflavina, 0,5 g/L; niacina, 0,5 g/L; piridoxina HCl, 0,5 g/L; inositol, 0,5 g/L; pantotenato de calcio, 0,5 g/L; ácido β-aminobenzoico, 0,5 g/L; biotina, 0,25 g/L), 2 ml de solución de selenita-tungstato (NaOH , 0,5 g/L; Na2SeO3·5H2O, 3 mg/L; Na2WO4·2H2O, 4 mg/L) y 2 mL de la solución de oligoelemento SL-10 (HCl, 2,8 g/L; FeCl2·4H2O, 1,5 g/ L; ZnCl2, 70 mg/L; MnCl2·4H2O, 100 mg/L; H3BO3, 6 mg/L; CoCl2·6H2O, 190 mg/L; CuCl2·2H2O, 2 mg/L; NiCl2·6H2O, 24 mg/ L; Na2MoO4·2H2O, 36 mg/L)43,44. El pH de ISEM se ajustó a 6,8 mediante la adición de HCl o NaOH. Se prepararon tres lotes de ISEM para evaluar las variaciones entre lotes. Sobre la base de la matriz tridimensional de excitación-emisión (3D-EEM) y los análisis espectroscópicos UV-vis, la composición de ISEM fue consistente en los lotes independientes (Figura complementaria 20). Se preparó medio mínimo M9 para evaluar la influencia de DAA en el crecimiento microbiano. El medio mínimo consistió en 2,0 g/L de glucosa, 6,0 g/L de Na2HPO4, 3,0 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1,0 g/L de NH4Cl, 0,12 g/L de MgSO4, 11,1 mg/L de CaCl2, 3,49 µg/l. L (NH4)6Mo7O24, 24,73 µg/L H3BO3, 3,90 µg/L CoCl2, 1,60 µg/L CuSO4, 10,07 µg/L MnCl2, 1,61 µg/L ZnSO4 y 0,15 mg/L FeSO4.

La cámara de microfluidos contiene una matriz de pilares, cada uno de 50 μm de diámetro y altura. El diseño del microcanal se expuso sobre una oblea de silicio mediante un sistema de escritura láser (Microwriter ML3). El grabado profundo de iones reactivos se llevó a cabo en la solución AZ400K:H20 (1:4) para generar la estructura microfluídica. La oblea de silicio grabada sirvió como molde maestro para fundir canales de polidimetilsiloxano (PDMS). El PDMS estampado se unió a un portaobjetos de vidrio después del tratamiento con plasma. Los chips de microfluidos se esterilizaron con etanol al 75% antes de la inoculación.

El chip de microfluidos comprendía un canal de flujo con una entrada y una salida. El tubo de entrada conectaba el chip de microfluidos a una jeringa que estaba montada en una bomba de jeringa para alimentar ISEM fresco para el crecimiento microbiano. En la salida se recogió el efluente que contenía células de vida libre (planctónicas) y exometabolitos. El sistema de flujo continuo proporcionó una condición constante y bien definida para el desarrollo de biopelículas y permitió el monitoreo continuo de la comunidad planctónica y la dinámica de los exometabolitos. Las células microbianas aisladas del suelo se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta una DO600 final de 0,1. Se introdujeron 200 μl de suspensión bacteriana del suelo en chips de microfluidos a través de un puerto de inoculación ubicado inmediatamente aguas abajo de la entrada del medio (Figura complementaria 21a). El tubo de entrada se sujetó antes de la inoculación para evitar el reflujo. La aguja de acero inoxidable se retiró después de inyectar el inóculo y luego se selló inmediatamente el puerto de inoculación con pegamento de silicona (Figura complementaria 21b). Después de una hora de conexión, se suministró a ISEM un caudal constante de 0,5 μl/min. Los chips de microfluidos se incubaron a 25 °C en la oscuridad. La aguja y el tubo de acero inoxidable en la salida se reemplazaron por otros estériles antes del muestreo. Se recogió el efluente de chips de microfluidos para determinar la densidad celular de las comunidades planctónicas. Posteriormente, se conectaron dos jeringas estériles a la entrada y salida del dispositivo de microfluidos. Se lavó repetidamente 1 ml de tampón PBS de un lado a otro entre estas dos jeringas a un caudal de aproximadamente 1200 μL/min veinte veces para extraer todas las células bacterianas en la cámara de microfluidos. La cantidad de células planctónicas y microbianas totales en los chips de microfluidos se cuantificó mediante qPCR utilizando el par de cebadores Eub338F (ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG) y Eub518R (ATT ACC GCG GCT GCT GG). Para construir la curva estándar para qPCR, el producto de PCR del organismo modelo P. putida KT2440 se clonó en el vector pMD8-T y se electroporó en células competentes de E. coli DH5α. Luego se amplificaron diluciones en serie del ADN plasmídico utilizando el SYBR Green PCR Supermix (BioRad). La eficiencia de amplificación determinada basándose en la curva estándar fue del 104,7%. La especificidad del producto amplificado se confirmó mediante análisis de curva de fusión y electroforesis en gel (Figuras complementarias 22 y 23). La cantidad de células de biopelícula se calculó como la diferencia entre el número de células totales y planctónicas:

donde Cplanktonic y Cbiofilm son los números de células planctónicas y de biopelículas en la cámara de microfluidos, Dplanktonic es la densidad celular en el efluente de la cámara de microfluidos, Vchip es el volumen de la cámara de microfluidos (3,0 μL) y Centire es el número total de células en el eluato de PBS.

Para evaluar el tiempo de residencia de las células planctónicas en una cámara de microfluidos, caracterizamos el transporte y retención de microesferas coloidales en el medio poroso. Las microesferas de poliestireno fluorescentes rojas adquiridas en Jiangsu Zhichuan Technology Co. (China) tienen un diámetro de 2 μm y una densidad de 1,05 g/cm3. Se bombearon 3 μl de tampón PBS que contenía las microesferas fluorescentes (1,0 x 105 partículas/μl) a la cámara de microfluidos a un caudal de 0,5 μl/min. Se recogieron 1,5 μL de efluente cada 3 minutos en la salida usando una pipeta y luego se diluyeron en 50 μL de tampón PBS en microplacas de 384 pocillos. La densidad de las partículas en el efluente se determinó midiendo la intensidad fluorescente (excitación, 370 nm; emisión, 610 nm) (Figura complementaria 2c). Se realizaron tres réplicas independientes. El tiempo medio de viaje (τ) se calculó de la siguiente manera45,46:

donde T es la duración de los experimentos, C(t) es la densidad de partículas en el efluente en el momento t.

Las biopelículas en cámaras de microfluidos se tiñeron con tintes fluorescentes y se observaron bajo un microscopio confocal (A1R, Nikon). Las células microbianas se tiñeron con DAPI o SYTO 9 durante 30 min. Ambos tintes fluorescentes se unen al ADN genómico y producen fluorescencia superpuesta (Figura complementaria 24). Las imágenes confocales se analizaron mediante un código MATLAB escrito a medida. Después de la binarización de la imagen, el espesor de la biopelícula en cada grano se calculó como la distancia radial promedio desde los puntos en los bordes de la biopelícula hasta la superficie del grano. La rugosidad de la biopelícula estuvo representada por la desviación estándar del espesor de la biopelícula en las superficies de los granos46.

Se utilizó PSE227-Alexa488 (5′-AAT CCG ACC TAG GCT CAT C-3′) para visualizar la distribución de Pseudomonas en la biopelícula47. Para diseñar una sonda FISH para cepas de Arthrobacter, se generó una secuencia consenso para 292 aislados de Arthrobacter de la cámara de microfluidos utilizando Usearch y la secuencia de la sonda se diseñó mediante el cebador 348,49. Se utilizó ART179 marcado con Alexa546 (5′-CAT GCG TGG AGC GGT CGT-3') para rastrear Arthrobacter. Las sondas se validaron con cultivos puros (Figuras complementarias 25 y 26). La sonda bacteriana universal EUB338 (5′-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3') y la sonda sin sentido (5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC-3') se utilizaron como control positivo y negativo, respectivamente. Todas las sondas FISH fueron sintetizadas por Thermo Fisher Scientific (Guangzhou, China). La especificidad y sensibilidad de FISH se evaluaron calculando la tasa de detección, que es la proporción de células teñidas con DAPI detectadas por FISH. Las altas tasas de detección de muestras positivas y pocas señales falsas positivas inespecíficas indican que el análisis FISH es un enfoque factible y confiable para cuantificar Pseudomonas y Arthrobacter (Figura complementaria 27). Se realizó FISH en cámaras de microfluidos50. Todos los reactivos se entregaron a la cámara de microfluidos a un caudal de 0,5 μl/min. La biopelícula se fijó inicialmente en una solución de formaldehído al 2% durante 1,5 h y se lavó con tampón PBS durante 40 min. La fijación con formaldehído preserva la integridad de la biopelícula para el tratamiento previo posterior de la muestra (Figura complementaria 28). Luego, la muestra de biopelícula fijada se permeabilizó con 10 mg/ml de lisozima durante 40 minutos a 37 °C, seguido de un paso de lavado. La deshidratación se realizó haciendo fluir una solución de etanol al 50%, 80% y 98% a través de la cámara durante 20 minutos, respectivamente. 2 ml del tampón de hibridación incluían 600 µl de formamida, 998 µl de agua, 360 µl de NaCl 5 M, 40 µl de Tris-HCl 1 M y 2 µl de SDS al 10 %. La sonda FISH se añadió al tampón de hibridación hasta una concentración final de 2,5 ng/μl. El tampón de hibridación se cargó en la cámara durante 30 minutos y se dejó durante 3 horas a 48 °C. Luego, la muestra se lavó con el tampón de lavado (Tris-HCl 20 mM, NaCl 102 mM, EDTA 5 mM y SDS al 0,01%) a 48 °C durante 40 minutos antes de la observación microscópica.

Para investigar la composición de la comunidad microbiana en las cámaras de microfluidos, las células microbianas de las cámaras de microfluidos se eliminaron con tampón PBS. El ADN total se extrajo utilizando el kit de ADN del suelo EZNA (Omega). Los cebadores universales 338F/806R se utilizaron para la amplificación del gen 16S rRNA51. La amplificación se llevó a cabo utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad (NEB) Q5. El programa de PCR comprendió 2 minutos de desnaturalización inicial del ADN a 98 °C; 25 ciclos a 98 °C por 15 s, 55 °C por 30 s y 72 °C por 30 s; y 30 s de extensión a 72 °C. Los amplicones se purificaron utilizando VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme) y luego se secuenciaron en la plataforma de secuenciación Illumina Miseq con lecturas de extremos emparejados de 300 pb. En cada punto de muestreo, las comunidades microbianas, incluidas las biopelículas y las células planctónicas, se recolectaron de tres chips de microfluidos independientes. Las comunidades planctónicas se evaluaron recogiendo el efluente de chips de microfluidos.

Para dilucidar la dinámica de los metabolitos extracelulares, el efluente de los chips de microfluidos se sometió a análisis metabolómicos. Se recogieron 100 μl de efluente de cada uno de los seis chips de microfluidos independientes en cada momento. El efluente se filtró a través de un filtro de PVDF de microcentrífuga de 0,2 µm para eliminar las células bacterianas. El filtrado se agitó con 400 μl de metanol/acetonitrilo preenfriado (50/50 v/v), se dejó a -20 °C durante 30 min y luego se centrifugó a 14.000 x g durante 20 min. El sobrenadante se liofilizó y se resuspendió en 100 µl de una solución de acetonitrilo/agua 50:50. Después de centrifugar a 14.000 x g durante 15 minutos, el sobrenadante se recogió para medir por LC-MS/MS. Se prepararon muestras de control de calidad (QC) combinando alícuotas iguales de las 42 muestras de efluentes recolectadas durante el período de incubación. Se inyectaron cinco alícuotas de muestras de control de calidad antes del análisis y después de cada diez ejecuciones para acceder a la varianza analítica (Figuras complementarias 29 y 30). La metabolómica no dirigida se realizó con el sistema UHPLC Ultimate 3000 equipado con un espectrómetro de masas Q-Exactive Orbitrap. La fase móvil A es ácido fórmico al 0,1% y la fase móvil B es acetonitrilo. Las condiciones del gradiente de disolvente fueron las siguientes: 0–1,0 min, 95% A; 1,0–9,0 min, 95 ~ 0% A; 9,0–12,0 min, 0% A; 12,0 a 15,0 min, 95 % A, con un caudal de 0,3 ml/min. La cromatografía se realizó en una columna ACQUITY UPLC BEH Amide (Waters, 1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm). La temperatura de la fuente ESI fue de 320 °C y el voltaje de pulverización se fijó en 3,5 kV. Se recogieron escaneos de espectros de masas desde m/z 80 a 1200 con un tiempo de acumulación de 200 ms. La adquisición MS/MS se realizó utilizando el modo de adquisición dependiente de información (IDA). La energía de colisión se fijó en 35 ± 15 eV.

Los datos de MS sin procesar se convirtieron al formato mzXML usando MSConvert (versión 3.0) y posteriormente fueron procesados ​​por XCMS (versión 3.2) para la selección y alineación de picos52. La identificación de metabolitos se realizó mediante comparación precisa de masa y MS/MS con las bibliotecas de referencia METLIN, MassBank, LipidMaps y mzCloud53,54,55. La similitud espectral MS/MS se representó mediante la puntuación del coseno56. Las configuraciones de XCMS fueron las siguientes: método = “centWave”, ppm = 15, ancho de pico = c(10,60), mzwid = 0,025, minfrac = 0,5 y bw = 5. Solo los metabolitos en el nivel 2 de identificación (compuestos supuestamente anotados) se utilizaron para el análisis estadístico posterior. Según la anotación KEGG, los metabolitos implicados en el metabolismo de los aminoácidos se clasificaron como aminoácidos intermedios.

Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron utilizando DADA2 (versión 2021.2.0) en QIIME2 (versión 2021.2) para fusionar y eliminar ruido de lecturas de extremos emparejados57,58. La taxonomía se asignó utilizando el clasificador Naive Bayes (versión 2021.2.0) y la base de datos Greengenes (versión 13.8)59. El árbol filogenético se construyó utilizando el proceso align-to-tree-mafft-fasttree60,61. Las áreas de los picos de los iones exometabolitos se transformaron en puntuaciones z. Todos los exometabolitos se agruparon en tres grupos según la correlación de rango de Spearman entre los períodos de incubación y la puntuación z de cada metabolito (Figura complementaria 15). Los exometabolitos con un coeficiente de correlación >0,5 se consideraron “liberados” y aquellos con un coeficiente inferior a −0,5 se consideraron “consumidos”62. Los metabolitos restantes se clasificaron como "otros".

El ensamblaje de la comunidad microbiana se evaluó mediante análisis de modelo nulo. Los mecanismos de ensamblaje comunitario se infirieron cuantitativamente mediante un análisis de modelo nulo basado en bins filogenéticos (iCAMP) utilizando el paquete "iCAMP" (versión 1.3.4)18. El análisis se realizó utilizando los parámetros recomendados por los desarrolladores18. El umbral de distancia filogenética se estableció en 0,2 y el tamaño mínimo del contenedor fue 12. Los 11.985 ASV observados se clasificaron en 442 contenedores filogenéticos diferentes. La distribución del modelo nulo se generó utilizando 1000 aleatorizaciones63. Se aplicó el algoritmo del modelo nulo “baraje de taxones” para barajar los taxones en el árbol filogenético y aleatorizar la relación filogenética dentro de los contenedores filogenéticos64. Se determinaron el índice de relación β-Net (βNRI) y las diversidades β taxonómicas utilizando la métrica de Raup-Crick (RC) modificada para identificar el proceso ecológico que gobierna cada contenedor. Los puntos de corte de valor significativo de βNRI, valor significativo de RC y nivel de confianza unilateral significativo fueron 1,96, 0,95 y 0,975, respectivamente. Se calculó la importancia relativa de diferentes procesos ecológicos en el recambio entre comunidades en chips e inóculos de microfluidos y las contribuciones de los contenedores filogenéticos individuales a los procesos ecológicos.

El cultivo bacteriano y el efluente se filtraron a través de filtros de 0,2 μm antes del análisis. La concentración total de AA libre se determinó mediante el analizador de aminoácidos A300 (membraPure). El sistema se calibró con una mezcla de aminoácidos estándar certificada de 17 aminoácidos proteinógenos (GBW(E)100062). La mezcla estándar se inyectó al inicio del análisis y después de cada 10 muestras para evaluar la estabilidad de la plataforma analítica. El AA libre se cuantificó mediante HPLC con detección de fluorescencia después de la derivatización previa a la columna con o-ftalaldehído (OPA) y N-isobutiril-L-cisteína (IBLC)65. Se mezclaron 0,5 µL de muestra con 2,5 µL de tampón de borato 0,4 M y luego se hicieron reaccionar con 0,25 µL de reactivo de derivación (IBLC 260 mM y OPA 170 mM en tampón de borato 0,4 M). Después de la dilución con 15 µl de ácido acético al 0,1%, se sometieron 15 µl de la mezcla a análisis por HPLC. La separación de los derivados de AA se realizó en una columna Agilent Poroshell HPH-C18 a 30 °C con un caudal de 0,7 ml/min. Se realizó una elución en gradiente dual con la fase móvil compuesta por acetato de sodio 50 mM (A) y acetonitrilo/metanol/agua (45/45/10) (B). El gradiente de disolvente fue el siguiente: 0–2 min, 4% B; 2 a 4 min, 10% B; 4 a 15 minutos, 20% B; 15 a 27 min, 35% B; 27 a 35 min, 50% B; 35–37, 100% B y se mantuvo durante 5 minutos más al 100% B. El eluido se controló utilizando un detector de fluorescencia (excitación a 230 nm y emisión a 450 nm). Se construyeron curvas de calibración para cada AA y sus enantiómeros (Figura complementaria 31). Se prepararon muestras de control de calidad a 1,0, 4,0 y 9,0 mg/l para evaluar la precisión y exactitud del método, que se expresaron como desviación estándar relativa y sesgo, respectivamente (Tabla complementaria 8). Se analizaron tres réplicas de cada nivel de control de calidad. La desviación estándar relativa (RSD, %) se calculó como desviación estándar/media × 100. El sesgo (%) se determinó como (concentración medida-concentración teórica)/concentración teórica × 100.

Para el aislamiento de la cepa, se recogió el cultivo microbiano en los chips de microfluidos después de 12, 36 y 96 h de crecimiento y se sembró en una placa de agar ISEM. Después de una incubación de 5 días a 25 °C, las colonias individuales se recogieron, se precultivaron en ISEM y luego se congelaron en glicerol al 25 % a -80 °C. Las cepas aisladas se identificaron mediante secuenciación de Sanger con cebadores universales 27F/1492R. Se aislaron un total de 764 cepas bacterianas de los chips de microfluidos. Estas cepas pertenecían a cinco géneros diferentes y cubrían miembros centrales planctónicos y de biopelículas, incluidos Arthrobacter, Rhodococcus, Pseudomonas, Staphylococcus y Pseudarthrobacter.

Los aislados bacterianos se precultivaron en ISEM. Después de 48 h de crecimiento, el cultivo bacteriano se lavó con tampón PBS y se resuspendió hasta una DO600 de 1,0. En la interacción de cocultivo por pares entre Arthrobacter y otras especies, se inocularon 200 μL de ISEM con 1 μL de cada cultivo. Para evaluar el efecto de los exometabolitos de las cepas de Arthrobacter, se cultivaron aislados bacterianos en un medio condicionado que consistía en el sobrenadante libre de células del cultivo de Arthrobacter e ISEM fresco. El sobrenadante de Arthrobacter, denominado medio gastado de Arthrobacter, se preparó cultivando cepas de Arthrobacter en ISEM durante 48 h, seguido de centrifugación y filtración25. El medio condicionado se preparó mezclando el medio gastado con un volumen igual de ISEM fresco. Cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos contenía 200 µl de medio acondicionado que se inoculó con 2 µl de cada aislado. Las microplacas se incubaron a temperatura ambiente durante 48 h. Las biopelículas en las microplacas se tiñeron con cristal violeta al 1%, se solubilizaron con etanol al 95% y se cuantificaron midiendo la absorbancia a 590 nm.

Las poblaciones bacterianas en monocultivo y cocultivo se cuantificaron mediante qPCR con cebadores específicos de género. El cultivo bacteriano se preparó y cultivó como se describe anteriormente para el análisis de interacción por pares. Las concentraciones celulares iniciales de la cepa idéntica en el monocultivo y en diferentes combinaciones de cocultivo fueron las mismas. Después de 24 h de crecimiento, las células planctónicas y las biopelículas adheridas a la superficie interna de las microplacas se recolectaron en la fase exponencial para evaluar la aptitud relativa de diferentes cepas66. El número total de células se calculó como la suma de la biopelícula y las células planctónicas. El ADN se extrajo utilizando el kit de ADN de bacterias TIANamp (TIANGEN). Se llevaron a cabo cuatro réplicas biológicas independientes. El programa de PCR fue el siguiente: 95 °C por 10 min, 40 ciclos de 95 °C por 15 s y 60 °C por 60 s, seguido de 15 s a 95 °C y 60 s a 60 °C. Los conjuntos de cebadores fueron ART-F (GGGGACATTCCACGTTT) y ART-R (GCACCTGTTTCCAGGCG) para cepas de Arthrobacter, PSE435F (ACTTTAAGTTGGGAGGAAGGG) y PSE686R (ACACAGGAAATTCCACCACCC) para cepas de Pseudomonas y Rho627F (ATTCCGTGGAAGGAACCCAC) y Rho885R (TCGCGTCGTTTGTGAAAACC) para Rho cepas de dococcus. La especificidad de los productos de PCR se verificó mediante electroforesis en gel y análisis de curva de fusión (Figuras complementarias 32 y 33). Como se describió anteriormente, se clonaron fragmentos de ADN diana en el vector pMD8-T para desarrollar las curvas estándar (Figura complementaria 33). Las eficiencias de amplificación calculadas a partir de las curvas estándar correspondientes fueron del 94,6% para Arthrobacter, del 94,8% para Pseudomonas y del 101,5% para Rhodococcus. Para estimar el número absoluto de células, se determinó la linealidad entre la amplificación por PCR y el número de unidades formadoras de colonias para cada cepa (Figura complementaria 34).

En la interacción de cocultivo, el rendimiento de biopelícula mínimo (Ymin), promedio (Yave), máximo (Ymax) y suma (Ysum) de cada aislado se determinó en función de la biopelícula cultivada en monocultivo67. La interacción de cocultivo se definió como positiva, cuando el rendimiento de biopelícula del cocultivo (Yco) fue mayor que Ysum (Yco > Ysum). La relación se consideró negativa si el biofilm de cocultivo era menor o igual a la suma de los monocultivos (Ysum ≥ Yco). La interacción co-cultivo fue fuertemente negativa cuando Yco fue menor que Ymin, mientras que se determinó una relación negativa débil cuando Ysum ≥ Yco ≥ Ymin. Para evaluar el efecto de los metabolitos extracelulares en la interacción social, se comparó la biopelícula o crecimiento planctónico en medio condicionado (Yc) con el de medio no condicionado (Yu)25. Una mayor biopelícula o crecimiento planctónico en medio condicionado (Yc ≥ Yu) indicó una interacción positiva. La interacción se clasificó como negativa débil cuando 1 > Yc/Yu ≥ 0,5. Una reducción sustancial en la biopelícula o el crecimiento planctónico (Yc/Yu < 0,5) fue una indicación de fuerte negativo.

El ADN total de ASV2 A. ramosus, ASV1 P. fluorescens y ASV11 R. erythropolis se extrajo utilizando el método del bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)68. La secuenciación del genoma completo se realizó en la plataforma Illumina NovaSeq PE150. El filtrado de calidad y la eliminación del adaptador se llevaron a cabo utilizando AdapterRemoval (versión 2.2.2)69. Las lecturas filtradas se ensamblaron mediante A5-MiSeq (versión 20160825)70 y SPAdes (versión 3.12.0)71. Los borradores de genomas se anotaron en la plataforma Integrated Microbial Genomes Expert Review (IMG ER). Los datos genómicos están disponibles en la base de datos IMG con los ID del genoma IMG de 2934219947, 2934206586 y 2934877363.

ASV1 P. fluorescens y ASV11 R. erythropolis se cultivaron en ISEM como monocultivo y en cocultivo con ASV2 A. ramosus. Después de 4 h de crecimiento, el cultivo bacteriano se recogió en la fase exponencial (Figura complementaria 35). El ARN total se extrajo mediante el método de extracción TRIzol72. La secuenciación de extremos emparejados se realizó en la plataforma Illumina NovaSeq PE150. Se utilizó Htseq-count (versión 1.6.0) para generar el recuento de lecturas de genes individuales y los genes expresados ​​diferencialmente (cambio de veces ≥2, valor de p <0,05) fueron identificados por DESeq2 (versión 1.28.1)73,74. 75. El análisis de enriquecimiento funcional KEGG se realizó utilizando ClusterProfiler (versión 4.0.0)76.

La producción de sideróforos por cepas de Pseudomonas y Rhodococcus se detectó mediante el ensayo CAS77,78. Las células bacterianas se cultivaron en ISEM durante 48 h. Se mezclaron 100 µl de sobrenadante filtrado con un volumen igual de solución de ensayo de CAS (CAS 1 mM, FeCl3 0,1 mM). La mezcla se dejó reposar durante 20 min y luego se midió la absorbancia a 630 nm. Se utilizó enterobactina, un sideróforo bacteriano, para construir la curva estándar (Figura complementaria 36).

El papel del sideróforo en la interacción microbiana se aclaró mediante la eliminación del gen de la sideróforo sintetasa (sfnaD, etiqueta de locus: Ga0508010_06_50115_52037) en ASV1 P. fluorescens mediante recombinación homóloga. La cepa mutante se construyó siguiendo un procedimiento previamente desarrollado79,80. Las regiones flanqueantes aguas arriba y aguas abajo de sfnaD se amplificaron con los pares de cebadores sidupS/sidupA y siddwS/siddwA, respectivamente. Los productos de la PCR se ligaron al plásmido suicida pDS3.0 para generar el plásmido pDS3.0-ΔsfnaD. Después de verificar el plásmido mediante secuenciación, se electroporó pDS3.0-ΔsfnaD en ASV1 P. fluorescens y se seleccionó en placas LB que contenían gentamicina 30 μg/ml. Las cepas con pDS3.0-ΔsfnaD luego se cultivaron en LB durante 48 h y luego se extendieron en placas de LB con 20% de sacarosa para detectar fenotipos positivos para sacarosa y negativos para gentamicina (mutante de deleción de sfnaD). La eliminación de sfnaD se verificó mediante amplificación por PCR y secuenciación (Figura complementaria 37). Los conjuntos de cebadores utilizados en este estudio se muestran en la Tabla complementaria 9. La producción de sideróforos de ΔsfnaD en ISEM estuvo por debajo del límite de detección (0,045 mM), lo que fue consistente con el tamaño reducido del halo de la colonia de ΔsfnaD en una placa de agar CAS (Fig. 38).

FAD, FMN y RF se identificaron y cuantificaron mediante LC-QTOF de alta resolución (1260–6540, Agilent) equipado con una columna ZORBAX SB-C18 (2,1 × 150 mm, 5 µm)81,82. Se usó un gradiente de fase móvil con metanol que contenía ácido acético al 0,5 % como fase móvil A y ácido acético al 0,5 % (pH 4,5) como fase móvil B. Las condiciones del gradiente de disolvente se aplicaron a un caudal de 0,2 ml/min de la siguiente manera: La fase móvil A aumentó del 7 al 100% durante los primeros 7 minutos, se mantuvo hasta los 9 minutos, luego volvió al 7% a los 14 minutos y se equilibró durante 4 minutos. Los estándares de flavina se compraron a Shyuanye Co. (China) para RF y FAD y a Bidepharm Co. (China) para FMN. Para confirmar la excreción de flavinas, se cultivó ASV1 P. fluorescens en ISEM y los metabolitos extracelulares se extrajeron utilizando el mismo enfoque que para el análisis del exometaboloma. El LC-QTOF se operó en modo de iones positivos. Los parámetros de MS se establecieron de la siguiente manera: temperatura del gas a 350 °C, gas nebulizador a 40 psi, voltaje capilar a 4000 V y fragmentador a 170 V. Las flavinas se identificaron haciendo coincidir la masa exacta y el tiempo de retención de los estándares auténticos (suplementario). Figura 39). Las flavinas se cuantificaron con un detector de diodos a 267 nm. Las curvas de calibración se prepararon por triplicado (Figura complementaria 40). La precisión y exactitud del método se evaluaron en tres niveles de concentración (Tabla complementaria 10).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos originales se proporcionan con este documento. Los datos sin procesar de amplicón y secuenciación transcriptómica se depositan en la base de datos NCBI SRA con el número de acceso PRJNA764456 y PRJNA813193. Las bibliotecas de referencia para la identificación de metabolitos están disponibles en METLIN (http://metlin.scripps.edu), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), LipidMaps (https://www.lipidmaps.org/), y mzCloud (https://www.mzcloud.org/). La referencia de taxonomía está disponible en la base de datos Greengenes (http://greengenes.lbl.gov). Se puede acceder a las vías KEGG a través de la base de datos KEGG (https://www.genome.jp/kegg/). Los datos genómicos de los aislados bacterianos están disponibles en la base de datos IMG (https://img.jgi.doe.gov/). Datos brutos que incluyen datos metabolómicos, imágenes confocales de biopelículas durante la colonización, dinámica de composición de la comunidad, metabolitos detectados en metabolómica, genes expresados ​​diferencialmente en datos transcriptómicos, rendimiento de biopelículas y crecimiento planctónico en monocultivo y cocultivo, abundancia de diferentes genotipos en cocultivo. y las concentraciones de AA durante el desarrollo de biopelículas se han depositado en la base de datos figshare (https://figshare.com/projects/Cooperative_interactions_drive_spatial_segregation/156834). Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código informático utilizado para el procesamiento de imágenes y el análisis del modelo nulo se almacenó en la base de datos figshare (https://figshare.com/projects/Cooperative_interactions_drive_spatial_segregation/156834).

Flemming, H.-C. & Wuertz, S. Bacterias y arqueas en la Tierra y su abundancia en biopelículas. Nat. Rev. Microbiol. 17, 247–260 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Battin, TJ, Besemer, K., Bengtsson, MM, Romani, AM y Packmann, AI La ecología y biogeoquímica de las biopelículas de corrientes. Nat. Rev. Microbiol. 14, 251–263 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hans-Curt, F. y col. ¿Quién puso la película en biopelícula? La migración de un término de la ingeniería de aguas residuales a la medicina y más allá. Microbiomas de biopelículas de NPJ 7, 1–5 (2021).

Google Académico

Hall-Stoodley, L., Costerton, JW y Stoodley, P. Biopelículas bacterianas: del entorno natural a las enfermedades infecciosas. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cordero, OX & Datta, MS Interacciones microbianas y ensamblaje comunitario a microescala. actual. Opinión. Microbiol. 31, 227–234 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilpiszeski, RL et al. Comunidades microbianas agregadas del suelo: hacia la comprensión de las interacciones del microbioma a escalas biológicamente relevantes. Aplica. Reinar. Microbiol. 85, e00324–00319 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nadell, CD, Drescher, K. & Foster, KR Estructura espacial, cooperación y competencia en biopelículas. Nat. Rev. Microbiol. 14, 589–600 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Datta, MS, Sliwerska, E., Gore, J., Polz, MF y Cordero, OX Las interacciones microbianas conducen a sucesiones rápidas a microescala en partículas marinas modelo. Nat. Comunitario. 7, 11965 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lawson, CE y cols. El análisis de la red metabólica revela interacciones de la comunidad microbiana en gránulos de anammox. Nat. Comunitario. 8, 15416 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blasche, S. y col. Cooperación metabólica y partición de nichos espaciotemporales en una comunidad microbiana de kéfir. Nat. Microbiol. 6, 196–208 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Enke, TN, Leventhal, GE, Metzger, M., Saavedra, JT y Cordero, OX La ecología a microescala regula la rotación de materia orgánica particulada en comunidades microbianas marinas modelo. Nat. Comunitario. 9, 2743 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, HJ, Boedicker, JQ, Choi, JW e Ismagilov, RF La estructura espacial definida estabiliza una comunidad bacteriana sintética de múltiples especies. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 105, 18188–18193 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Coyte, KZ, Tabuteau, H., Gaffney, EA, Foster, KR & Durham, WM La competencia microbiana en entornos porosos puede impedir el rápido crecimiento de biopelículas. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 114, E161-E170 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Nadell, CD, Ricaurte, D., Yan, J., Drescher, K. & Bassler, BL El entorno de flujo y la estructura de la matriz interactúan para determinar la competencia espacial en biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. eLife 6, e21855 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Gupta, S. y col. Investigar la dinámica de los consorcios microbianos en entornos espacialmente estructurados. Nat. Comunitario. 11, 2418 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, Y., Zaiden, N., Liu, X., Mukherjee, M. & Cao, B. Respuestas de bacterias exógenas a sustancias poliméricas extracelulares solubles en aguas residuales: un estudio mecanicista e implicaciones sobre el bioaumento. Reinar. Ciencia. Tecnología. 54, 6919–6928 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., De Anna, P. y Battin, TJ Desentrañando los fundamentos biofísicos del éxito de las biopelículas de múltiples especies en ambientes porosos. ISME J. 13, 1700-1710 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ning, D. y col. Un marco cuantitativo revela los impulsores ecológicos del ensamblaje de comunidades microbianas de pastizales en respuesta al calentamiento. Nat. Comunitario. 11, 1-12 (2020).

ADS del artículo Google Scholar

Eigentler, L. et al. La configuración de las células fundadoras impulsa resultados competitivos dentro de las biopelículas de colonias. ISME J. 16, 1512-1522 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharma, A. & Wood, KB Segregación espacial y cooperación en colonias microbianas en expansión radial bajo estrés antibiótico. ISME J. 15, 3019–3033 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bottery, MJ, Passaris, I., Dytham, C., Wood, AJ y van der Woude, MW La organización espacial de las colonias bacterianas en expansión se ve afectada por la inhibición del crecimiento dependiente del contacto. actual. Biol. 29, 3622–3634.e3625 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Frost, I. et al. Cooperación, competencia y resistencia a antibióticos en colonias bacterianas. ISME J. 12, 1582-1593 (2018).

Artículo MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, C.-H., Cao, H., Cai, P. y Sørensen, SJ La proporción de inoculación inicial regula las interacciones de cocultivo bacteriano y la capacidad metabólica. ISME J. 15, 29–40 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dolinšek, J., Ramoneda, J. & Johnson, DR La composición inicial de la comunidad determina la dinámica a largo plazo de una interacción de alimentación cruzada microbiana al modular la disponibilidad de nichos. Comunal ISME. 2, 77 (2022).

Artículo PubMed Central Google Scholar

de Vos, MG, Zagorski, M., McNally, A. & Bollenbach, T. Redes de interacción, estabilidad ecológica y tolerancia colectiva a los antibióticos en infecciones polimicrobianas. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 114, 10666–10671 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kolodkin-Gal, I. et al. Los D-aminoácidos desencadenan el desmontaje de la biopelícula. Ciencia 328, 627–629 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leiman, SA et al. Los D-aminoácidos inhiben indirectamente la formación de biopelículas en Bacillus subtilis al interferir con la síntesis de proteínas. J. Bacteriol. 195, 5391–5395 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chakraborty, P. et al. Los residuos de triptófano libre inhiben la detección de quórum de Pseudomonas aeruginosa: un enfoque potencial para inhibir el desarrollo de biopelículas microbianas. Arco. Microbiol. 200, 1419-1425 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sanchez, Z., Tani, A. & Kimbara, K. Reducción extensa de la viabilidad celular y producción mejorada de matriz en biopelículas de flujo PAO1 de Pseudomonas aeruginosa tratadas con una mezcla de D-aminoácidos. Aplica. Reinar. Microbiol. 79, 1396-1399 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Machado, D. et al. Polarización de comunidades microbianas entre metabolismo competitivo y cooperativo. Nat. Ecológico. Evolución. 5, 195–203 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Romdhane, S. y col. Desentrañar las interacciones bióticas negativas que determinan el ensamblaje y funcionamiento de la comunidad microbiana del suelo. ISME J. 16, 296–306 (2022).

Erktan, A., Or, D. & Scheu, S. La estructura física del suelo: determinante y consecuencia de las interacciones tróficas. Biol del suelo. Bioquímica. 148, 107876 (2020).

Rainey, PB y Rainey, K. Evolución de la cooperación y el conflicto en poblaciones bacterianas experimentales. Naturaleza 425, 72–74 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Madsen, JS y cols. El control facultativo de la producción de matriz optimiza la aptitud competitiva en modelos de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa PA14. Aplica. Reinar. Microbiol. 81, 8414–8426 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bittleston, LS, Gralka, M., Leventhal, GE, Mizrahi, I. y Cordero Sanchez, OX La dinámica dependiente del contexto conduce al ensamblaje de comunidades microbianas funcionalmente distintas. Nat. Comunitario. 11, 1-10 (2020).

Artículo de Google Scholar

Zhou, J. y Ning, D. Asamblea comunitaria estocástica: ¿importa en la ecología microbiana? Microbiol. Mol. Biol. Rev.81, e00002–e00017 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, Y., Zheng, Q., Zhang, S., Noll, L. y Wanek, W. Liberación significativa y utilización microbiana de aminoazúcares y enantiómeros de D-aminoácidos a partir de la descomposición de la pared celular microbiana en los suelos. Biol del suelo. Bioquímica. 123, 115-125 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aliashkevich, A., Alvarez, L. & Cava, F. Nuevos conocimientos sobre los mecanismos y funciones biológicas de los d-aminoácidos en ecosistemas complejos. Frente. Microbiol. 9, 683 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Langerhuus, AT et al. Abundancia de endosporas y modelado de D: L-aminoácido del recambio bacteriano en sedimentos marinos del holoceno (Bahía de Aarhus). Geochim. Cosmochim. Acta 99, 87–99 (2012).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Vranova, V. y col. La importancia de los D-aminoácidos en el suelo, su destino y su utilización por microbios y plantas: revisión e identificación de lagunas de conocimiento. Suelo vegetal 354, 21–39 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Lindahl, V. & Bakken, LR Evaluación de métodos para la extracción de bacterias del suelo. Microbiol FEMS. Ecológico. 16, 135-142 (1995).

Artículo CAS Google Scholar

Nguyen, TM et al. Método eficaz de extracción del suelo para cultivar bacterias del suelo no cultivadas previamente. Aplica. Reinar. Microbiol. 84, e01145–01118 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tschech, A. & Pfennig, N. Aumento del rendimiento del crecimiento relacionado con la reducción del cafeato en Acetobacterium woodii. Arco. Microbiol. 137, 163–167 (1984).

Artículo CAS Google Scholar

Widdel, F., Kohring, G.-W. & Mayer, F. Estudios sobre bacterias reductoras de sulfato disimilatorias que descomponen los ácidos grasos. Arco. Microbiol. 134, 286–294 (1983).

Artículo CAS Google Scholar

Yu, C., Warrick, AW y Conklin, MH Un método de momento para analizar curvas de avance de entradas escalonadas. Recurso Acuático. Res. 35, 3567–3572 (1999).

ADS del artículo Google Scholar

Wu, Y., Mohanty, A., Chia, WS & Cao, B. Influencia de la 3-cloroanilina en el estilo de vida de la biopelícula de Comamonas testosteroni y sus implicaciones en el bioaumento. Aplica. Reinar. Microbiol. 82, 4401–4409 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watt, M., Hugenholtz, P., White, R. y Vinall, K. Números y ubicaciones de bacterias nativas en raíces de trigo cultivadas en el campo cuantificadas mediante hibridación fluorescente in situ (FISH). Reinar. Microbiol. 8, 871–884 (2006).

Artículo PubMed Google Scholar

Edgar, RC Búsqueda y agrupación de órdenes de magnitud más rápido que BLAST. Bioinformática 26, 2460–2461 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Untergasser, A. y col. Primer3: nuevas capacidades e interfaces. Ácidos nucleicos res. 40, e115 – e115 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sieben, VJ, Debes-Marun, CS, Pilarski, LM y Backhouse, CJ Un chip de microfluidos integrado para la enumeración de cromosomas mediante hibridación fluorescente in situ. Chip de laboratorio 8, 2151–2156 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wu, Y. et al. La formación de biopelículas del suelo mejora la diversidad de la comunidad microbiana y la actividad metabólica. Reinar. En t. 132, 105116 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cámaras, MC y col. Un conjunto de herramientas multiplataforma para espectrometría de masas y proteómica. Nat. Biotecnología. 30, 918–920 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Horai, H. y col. MassBank: un repositorio público para compartir datos espectrales de masas para las ciencias biológicas. J. Espectro de masas. 45, 703–714 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Sud, M. y col. Lmsd: base de datos de estructura de mapas de lípidos. Ácidos nucleicos res. 35, D527–D532 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wang, J., Peake, DA, Mistrik, R. & Huang, Y. Una plataforma para identificar metabolitos endógenos utilizando un novedoso Orbitrap MS de alto rendimiento y la biblioteca mzCloud. Sangre 4, 2–8 (2013).

Google Académico

Stein, SE y Scott, DR Optimización y prueba de algoritmos de búsqueda de bibliotecas de espectros de masas para la identificación de compuestos. Mermelada. Soc. Espectro de masas. 5, 859–866 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Caporaso, JG et al. QIIME permite el análisis de datos de secuenciación comunitaria de alto rendimiento. Nat. Métodos 7, 335–336 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Callahan, BJ y cols. DADA2: inferencia de muestras de alta resolución a partir de datos de amplicones de Illumina. Nat. Métodos 13, 581–583 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schloss, PD y cols. Presentamos mothur: software de código abierto, independiente de la plataforma y respaldado por la comunidad para describir y comparar comunidades microbianas. Aplica. Reinar. Microbiol. 75, 7537–7541 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katoh, K. & Standley, DM MAFFT software de alineación de secuencias múltiples versión 7: mejoras en el rendimiento y la usabilidad. Mol. Biol. Evolución. 30, 772–780 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Price, MN, Dehal, PS y Arkin, AP FastTree 2: árboles de probabilidad máxima aproximada para alineaciones grandes. MÁS UNO 5, e9490 (2010).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Swenson, TL, Karaoz, U., Swenson, JM, Bowen, BP y Northen, TR Vinculación de la biología y la química del suelo en la corteza biológica del suelo mediante exometabolómica aislada. Nat. Comunitario. 9, 19 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kembel, SW y cols. Picante: Herramientas R para la integración de filogenias y ecología. Bioinformática 26, 1463-1464 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kembel, SW Desenredar las influencias neutrales y de nicho en la asamblea comunitaria: evaluación del desempeño de las pruebas de estructura filogenética de la comunidad. Ecológico. Letón. 12, 949–960 (2009).

Artículo PubMed Google Scholar

Müller, C., Fonseca, JR, Rock, TM, Krauss-Etschmann, S. & Schmitt-Kopplin, P. Enantioseparación y detección selectiva de D-aminoácidos mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento/espectrometría de masas en análisis de complejos muestras biológicas. J. Cromatogr. A 1324, 109-114 (2014).

Artículo PubMed Google Scholar

Hall, BG, Acar, H., Nandipati, A. y Barlow, M. Tasas de crecimiento simplificadas. Mol. Biol. Evolución. 31, 232–238 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Madsen, JS y cols. La coexistencia facilita la formación de biopelículas interespecíficas en comunidades microbianas complejas. Reinar. Microbiol. 18, 2565–2574 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

William, S., Feil, H. y Copeland, A. Aislamiento de ADN genómico bacteriano mediante CTAB. Sigma 50, 6876 (2012).

Schubert, M., Lindgreen, S. y Orlando, L. AdapterRemoval v2: recorte rápido de adaptadores, identificación y fusión de lecturas. Res. BMC. Notas 9, 1 a 7 (2016).

Artículo de Google Scholar

Coil, D., Jospin, G. & Darling, AE A5-miseq: un proceso actualizado para ensamblar genomas microbianos a partir de datos de Illumina MiSeq. Bioinformática 31, 587–589 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bankevich, A. y cols. SPAdes: un nuevo algoritmo de ensamblaje del genoma y sus aplicaciones a la secuenciación unicelular. J. Computación. Biol. 19, 455–477 (2012).

Artículo MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rio, DC, Ares, M., Hannon, GJ y Nilsen, TW Purificación de ARN utilizando TRIzol (reactivo TRI). Puerto de primavera fría. Protocolo. 2010, prot5439 (2010).

Artículo de Google Scholar

Anders, S., Pyl, PT y Huber, W. HTSeq: un marco de Python para trabajar con datos de secuenciación de alto rendimiento. Bioinformática 31, 166-169 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Estimación moderada del cambio de pliegue y la dispersión para datos de RNA-seq con DESeq2. Genoma Biol. 15, 1-21 (2014).

Artículo de Google Scholar

Gao, C.-H. et al. La adaptación transcripcional emergente facilita la sucesión convergente dentro de una comunidad sintética. Comunal ISME. 1, 1–5 (2021).

Artículo de Google Scholar

Wu, T. y col. clusterProfiler 4.0: una herramienta de enriquecimiento universal para interpretar datos ómicos. Innovación 2, 100141 (2021).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Schwyn, B. & Neilands, J. Ensayo químico universal para la detección y determinación de sideróforos. Anal. Bioquímica. 160, 47–56 (1987).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wu, Y. et al. El análisis comparativo del genoma revela la adaptación genética a condiciones ambientales versátiles y la importancia del estilo de vida de biopelículas en Comamonas testosteroni. Aplica. Microbiol. Biotecnología. 99, 3519–3532 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Xiao, Y. et al. Identificación de nuevos genes diana regulados por c-di-GMP/FleQ, incluido cyaA, que codifica la adenilato ciclasa, en Pseudomonas putida. mSystems 6, e00295–00221 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, X. et al. RsmA3 modula RpoS a través de la vía de señalización RetS-Gac-Rsm en respuesta al estrés por H2O2 en el fitopatógeno Pseudomonas syringae. Reinar. Microbiol. 24, 4755–4770 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yang, Y. et al. Aprovechar el periplasma de las células bacterianas para desarrollar biocatalizadores para la biosíntesis de sustancias químicas de alta pureza. Aplica. Reinar. Microbiol. 84, e01693–01617 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Monteverde, DR et al. Distribución de flavinas extracelulares en una cuenca marina costera y su relación con los gradientes redox y los miembros de la comunidad microbiana. Reinar. Ciencia. Tecnología. 52, 12265–12274 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Descargar referencias

YW y PC reconocen la financiación del Programa Nacional de Investigación Clave de China (2020YFC1806802), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (42225706, 42177281, 42177283), la Beca Newton Advance de la Royal Society (NAF/R1/191017) y los Fondos de Investigación Fundamental para el Universidades Centrales (2662022ZHYJ001, 2662021JC012, 2662023PY010). CLP reconoce la financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 725613 MinOrg). KX está financiado por el Programa de los Cien Talentos de la Academia de Ciencias de China. Agradecemos a la Asoc. Prof. Yujie Xiao y Meina He por su inestimable ayuda en la construcción de mutantes. También nos gustaría agradecer al Prof. Feng Ju y al Prof. Shuo Jiao por sus útiles comentarios y sugerencias.

Estos autores contribuyeron igualmente: Yichao Wu, Chengxia Fu.

Laboratorio Estatal Clave de Microbiología Agrícola, Facultad de Recursos y Medio Ambiente, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan, China

Yichao Wu, Chengxia Fu, Chunhui Gao, Jun Liu, Qiaoyun Huang y Peng Cai

Escuela de Tierra y Medio Ambiente, Universidad de Leeds, Leeds, LS2 9JT, Reino Unido

Caroline L. Peacock y Ke-Qing Xiao

Sección de Microbiología, Departamento de Biología, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Soren J. Sorensen

Departamento de Horticultura Ambiental, Royal Horticultural Society, Wisley, Surrey, GU23 6QB, Reino Unido

Marc A. Redmile-Gordon

Laboratorio Estatal Clave de Ecología Urbana y Regional, Centro de Investigación de Ciencias Ecoambientales, Academia China de Ciencias, Beijing, China

Ke-Qing Xiao y Yongguan Zhu

Facultad de Física, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Wuhan, China

Zixue Li y Peiyi Song

Laboratorio Clave de Salud y Medio Ambiente Urbano, Instituto de Medio Ambiente Urbano, Academia China de Ciencias, Xiamen, China

Yongguan Zhu

Instituto de Genómica Ambiental y Departamento de Microbiología y Biología Vegetal, Universidad de Oklahoma, Norman, EE.UU.

Jizhong Zhou

Laboratorio Conjunto Estatal Clave de Simulación Ambiental y Control de la Contaminación, Escuela de Medio Ambiente, Universidad de Tsinghua, Beijing, China

Jizhong Zhou

Ciencias de la Tierra y el Medio Ambiente, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, Berkeley, EE. UU.

Jizhong Zhou

Escuela de Ingeniería Civil y Ciencias Ambientales, Universidad de Oklahoma, Norman, EE.UU.

Jizhong Zhou

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

YW y PC concibieron y diseñaron el proyecto. YW y CF realizaron los experimentos y analizaron los datos. PS y ZL fabricaron los chips de microfluidos. YW y CF interpretaron los datos en discusión con PC y CLPYW y CF escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Peng Cai.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Wu, Y., Fu, C., Peacock, CL et al. Las interacciones microbianas cooperativas impulsan la segregación espacial en ambientes porosos. Nat Comuna 14, 4226 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39991-4

Descargar cita

Recibido: 26 de mayo de 2022

Aceptado: 05 de julio de 2023

Publicado: 15 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39991-4

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.